Sainte Anne, la Vierge, l'Enfant Jésus et saint Jean-Baptiste enfant

Les trois générations de la famille du Christ sont ainsi représentées : Sainte Anne tient sa fille Marie sur ses genoux et cette dernière distrait l'Enfant qui se tourne vers Saint Jean. Il existe un jeu subtil entre les regards des quatre personnages, Sainte Anne souriant à sa fille Marie, tandis que les yeux de Marie sont fixés sur son fils, que Saint Jean regarde également.

Sainte Anne lance à la Vierge un regard étrange, plein d'émotion, comme si elle imaginait déjà les souffrances que Marie devra endurer pendant la Passion du Christ. La délimitation des quatre corps est peu claire ; les têtes des deux femmes, en particulier, semblent émerger du même corps. Léonard s'est efforcé de reproduire un sens polycentrique du mouvement, de sorte que les deux figures se fondent en un seul complexe, dans lequel se détache la tête de sainte Anne. L'expression de la Vierge Marie est extraordinairement tendre, mais en même temps son visage est d'une beauté majestueuse, d'un autre monde, suggérant une profonde dévotion maternelle.